シークエンス反応

先にテンプレートDNAを2ulずつ8連のPCRチューブに分注しておく。

PCRの電源をいれ、F5(User)からotaniにカーソルを合わせF1(Accept)を押す。

トップ画面に戻ったらF1(Run)を押し、ceqenceにカーソルを合わせてF1(Start)を押す。

Select Method Options画面で留めて、上ぶたの温度が上昇して使用可能になるまでの間に試薬を作成する。

以下の作業は全て氷上で行う。

試薬は以下のとおりである。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　×100

テンプレートDNA　　 2ul 　　　　(テンプレート量を200~400ngにすると良い結果が得られている。)

Big Dye 0.3ul　 　　　 30ul

5×Sequence Buffer 4ul　　　　 　400ul

Primer#80(12.5pmol/ul) 0.25ul 　　 　25ul(研究室にあるストックを1/8希釈して使用する。)

MQ 13.45ul　 　1345ul

total 20ul　　　　2000ul

MQ→5×B→Primer→Big Dyeの順番で2mlエッペンチューブに加え、ボルテックスでよく懸濁する。

試薬を225ulずつ新品の8連チューブに加え、12連のピペットマンを利用して18ulずつDNAの入った8連チューブに分注する。

8連チューブにふたをする。ただし、できる限り常温にさらさないようにする。

ふたをする際は、氷上でふたを置き、すばやく机上でふたを閉め、氷上に深くPCRチューブをさしてしばし置き、再び机上で、ペン先でしっかりふたを閉めて氷上に戻す。

ふたを閉めたら卓上遠心機で壁面の液体を落とす。

PCRの、Select Method Options画面のReaction volumeが20ulになっているかを確認して、F1(Start)を押す。

PCRチューブはPCRの温度が96℃になってから入れる。

反応は以下のとおりである。

シーケンス反応

96℃　　　　　2min

96℃ 10sec

35cycles

50℃ 5sec

60℃ 4min

4℃　　　　　　∞

反応が終了したら冷蔵庫で保存する。

Shephadexを用いたゲル濾過

・ゲル濾過用Shephadexの作成

3gのshephadex G-50(Fine Grade)を50mlのファルコンチューブに入れ、MQを50ml加え一晩静置する。

その後4℃で保存する。

・使用法

Shepadex を良く混ぜマルチスクリーンに300ul加える

マルチスクリーンをPCRプレート上に置き、1000rpm、RTで5min遠心する。

5min遠心後、プレートの中心側と外側を逆にして1000rpm、RTで5min遠心する。

ゲルの入ったマルチスクリーンを新品のPCRプレート上に乗せかえる。

マルチスクリーンのウェルの真ん中に反応溶液をアプライする

1000rpm、RTで5min遠心する。

5min遠心後、プレートの中心側と外側を逆にして1000rpm、RTで5min遠心する。

遠心後、PCRプレートにセプターをつけてシーケンサーで読む。

※マルチスクリーンは詰まってしまうと再利用できないので、シーケンスを読む前に洗浄する必要がある。

マルチスクリーンを逆にして軽くたたきゲルを落とし、水道水で水圧洗浄をしてからDWでよくすすぐ。

すすいだら遠心機で水気を飛ばすために軽く遠心して乾燥させる。
シーケンスデータ解析

デスクトップ上のSequence Scanner v1.0を開く

Import Tracesを押す。解析したいファイルを選んで、Add Selected Tracesを押す。

右側のTrace To Add選んだファイルが出るので、その後にOKを押す。

メイン画面に選んだファイルがリストアップされるので、ファイルをダブルクリックする。

ダブルクリックをすると計測した結果の波形が出る。

Sequenceボタンを押すと塩基配列の解析結果が出るので、この文字列をコピー(Ctrl + c)する

先頭の配列はプライマー領域も含まれているのでここは除く。

コピーした結果はインターネット上のデータベースサイト、KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)で目的の遺伝子が入っているか解析をする。

KOMEのトップページからSimilarity Searchを選び、Sequenceに解析結果をペースト(Ctrl + v)して、Startを押す。

検索結果が複数出た場合は、上から可能性が高いものが順番に出るので、基本的には一番上のものを確認する。

そのほかの判断方法としては、データベース上のデータとIdentities (%)が高いもの、Sbjctの開始位置(Fwから読んでいるのに1000base〜の結果というものは排除する。)で判断をする。

目的の遺伝子が挿入されているのを確認できたら、Accessionと塩基配列をコピーして、シークエンス日、シークエンスファイル名、実験ナンバー、アクセッションを書き加えてプリントアウトする。次ページがテンプレートである。

1304(Sample Noを記入)

 
>ACCESSION=AK104082|CLONE_ID=101524|CLONE_NAME=001-029-
 C02|CLUSTER_ID=5145|FAIS
 Length = 1686
 
 Score = 226 bits (114), Expect = 4e-59
 Identities = 114/114 (100%)
 Strand = Plus / Minus
 
  
Query: 1 aagttattaattgcgcagtgttatgaatttgctactcaaatctgccaaacatcttctcca 60
 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1662 aagttattaattgcgcagtgttatgaatttgctactcaaatctgccaaacatcttctcca 1603
 
 
Query: 61 ccgctcaaacgtacgtgaatcagaacacatacatatatgtaggcatccttgcgt 114
 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1602 ccgctcaaacgtacgtgaatcagaacacatacatatatgtaggcatccttgcgt 1549
(白抜き部分をコピーして貼り付ける)
 
 

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シークエンス日：20101129　(シーケンサーを使った日付を記入)

解析データ：1_C11_005.ab1　(解析に使った○○.ab1ファイルを記入)

シークエンス番号：1　(シーケンスを行った時にサンプルにつけた番号を記入)

注文書番号：1304　(Sample Noを記入)

アクセッション：AK102326　(AKから始まるアクセッションを記入)