1. 試料（組織の場合、25～100 mg）に ISOGEN 1 ml を添加し、細胞を溶解する。

1.液体窒素中で凍結粉砕した試料を、あらかじめ 50℃に温めておいた ISOGEN 中に入れ

てホモジナイズし、50℃で 10 分間温浴する。温浴後、激しく混和してから遠心（12 K×g, 10 分間, 4℃）し、沈殿物を取らないよう上清を 1 ml ずつ別のチューブに移す。夾雑物の多い試料（種子、球根など）は、この上清をいったん凍結（-80℃, 1 時間放置）させて室温で融解してから遠心して、析出した残さを取らないよう上清を 1 ml ずつ新しいチューブに移す。

2. 1.のホモジネートを室温で 5 分間放置したら、200 µl（使用した ISOGEN 量の 0.2

倍量） のクロロホルムを添加する。 15 秒間激しく混和し、室温で 2 分間放置した後、遠心（12 K×g, 15 分間, 4℃）する。

3. 上層の RNA を含む水相を 400 µl 取り、新しいチューブに移す。

4. 3.に同量（400 µl）の 70%エタノールを添加し、転倒混和する。

5. 4.を全量（800 µl）、Spin Column にアプライし、蓋を閉めて遠心（12 K×g, 15 秒間, 4℃） する。 Spin Column は、カラムにコクレションチューブをセットして使用します。

6. ろ液を 700 µl 取って新しいマイクロチューブに移し、200 µl のイソプロパノールを加えて 混和する。この混合液は 8.で用いる。 ろ液回収後のコレクションチューブは、カラム部に再度セットして 7.に進む。

プロトコール 6.の段階で（IsoWash I での洗浄前に）、DNase I (RNase free) (Code No. 314-08071) を用いて行える。あらかじめ下記のとおり調製した DNase 溶液 100 µl を Spin Column にアプライして、15 分間室温で放置する。その後は次のプロトコール 7.に進む。DNase 溶液（用事調製）： チューブに 30 units の DNase I (RNase free)と、酵素添付の反応用バッファー(10×Buffer)を 10 µl 加え、RNase フリー水で 100 µl にし、軽くピペッティングして混合する。

7. 6.の Spin Column に、500 µl の IsoWash I をアプライし、遠心（12 K×g, 15 秒間, 4℃） してろ液を捨てる。

8. 7.の Spin Column に 6.の混合液（ろ液＋イソプロパノール）を全量アプライし、 遠心（12 K×g, 15 秒間, 4℃）してろ液を捨てる。

9. 8.の Spin Column に、300 µl の IsoWash II をアプライし、遠心（12 K×g, 15 秒間, 4℃） する。

10. 9.の Spin Column に再度 300 µl の IsoWash II をアプライし、遠心（12 K×g, 1 分間, 4℃） してろ液とコレクションチューブを捨てる。

11. 10.の Spin Column のカラム部に新しいマイクロチューブをセットする。TE または RNase フリー水を 20～50 µl アプライし、1 分間放置する。

12. 遠心（12 K×g, 1 分間, 4℃または室温）して RNA を溶出する。