イネカルスからのタンパク抽出法

継代後3-5日目のカルスを材料にした場合を例にする。

1. 遠心機を4℃に予備冷却しておく。

2. 液体培養を止めて、細胞を茶こしに集める。

3. キムワイプで軽く水分を取り除く。

4. マイクロチューブに100mg（FW）を入れる。

5. チューブを氷上に移す。

6. 5倍容のタンパク抽出バッファーに以下の試薬を加える。

1/200量のβ-メルカプトエタノールを加える（直前調製）

1/30量のPMSF（プロテアーゼインヒビター）を加える（直前調製）

100mgにつき10μlのProtein Inhibitorを加える（必要時）

7. 6をサンプルに加え、ホモジェナイズペッスルを使ってホモジェナイズする。電動ドリルを使った方が抽出効率が上がる.

8. 15000rpm　20min　4℃で遠心する。

9. 上清を新しいチューブに移し、これをタンパク粗抽出液とする。通常3-7ug/ulのタンパクが抽出できる。

タンパク抽出バッファーの組成

0.1M　Tris-HCl(pH7)・・・・・・・・・葉緑体の酸素発生系の阻害作用

10mM DTT・・・・・・・・・・・・・・SH基保護効果　抽出直前に加えるのが効果的

5mM EDTA・・・・・・・・・・・・・・メタロプロテアーゼ阻害剤

1% Polyvinylpyrolidone・・・・・・・・フェノール化合物吸着剤

β-メルカプトエタノール・・・・・・・・1/200量直前調製　DTTと同様の効果

30mM　PMSF・・・・・・・・・・・・・1/30量直前調製　プロテアーゼ阻害剤

Protein Inhibitor (sigma　P9599)　阻害剤のカクテル　　100mgのサンプルに10μl加える。