プラスミドDNAの調製

1. TB培地　約2.5mlに竹串または楊枝でシングルコロニーを植菌する（オープンで良い）

2. 37℃でO/N振とう培養する

3. 2mlのマイクロチューブに培養液を入れて、5000 rpm, 1 min 遠心し、上清を捨て、キムワイプ上に逆さまにして培養上清を良く取り除く。上清は廃液入れに。培養チューブはアルカリを入れたバケツにいれる。

4. 　　μlのPDA1を加え、卓上ミキサーで再懸濁する（ペレットを完全に懸濁するのがコツ）。

5. 　　μlのPDA2を加え、10回ゆっくりと上下転倒（Inversion）して、室温で2分間静置する（ここで激しく混ぜると大腸菌の染色体DNAまで抽出される。

6. 　　μlのPDA３を加え、ゆっくりと10回上下転倒（Inversion）する。最初５回はゆっくり、残りの５回（中和後）は普通に混ぜて良い。

7. 15000　rpm,　5min以上　室温で遠心する。

8. スピンカラムの蓋にサンプル番号を書き、吸引装置にセットする。

9. 7.のサンプルをデカンテーションで移す。

10. 　　　μlのW1バッファーを入れる。

11. 　　　μlのWashバッファーを入れる。

12. カラムをエンプティーチューブ（蓋の無いチューブ）に移して、15000　rpm,　２min　室温で遠心する（カラムの乾燥）。

13. 新しい1.5mlのチューブにサンプル番号を書いて、12.のカラムをセットする。

14. 50μlのElution Buffer をカラムの中心にアプライする（プラスミドの溶出）。

15. 2min間静置する（時間の短縮は厳禁）。

16. 15000　rpm,　1min　室温で遠心する。

17. カラムを捨てて、蓋を締めて冷凍庫で保存する。

18. 2μlを電気泳動し、プラスミドの濃度とRNAがコンタミしていないことを確認する。