プラスミドDNAの調製
1.
LA or TB培地 3mlに竹串または楊枝でシングルコロニーを植菌する(オープンで良い)
2.
37℃でO/N振とう培養する
3.
Usedのマイクロチューブに培養液を入れて、5000 rpm, 1 min 遠心し、上清を捨て、キムワイプ上に逆さまにして培養上清を良く取り除く。上清は廃液入れに。培養チューブはアルカリを入れたバケツにいれる。
4.
100μlのSolI 1xLysozyme Bufferを加え、卓上ミキサーで再懸濁する。
5.
200μlのSolII(溶菌)SDS NaOH溶液を加え、3-5回Inversionして直ちに氷上に移し、そのまま3min静置する。
6.
150μlのSolIII(中和)を加え、10回くらいInversionして、さらに5min氷上で静置する。
7.
10μlのクロロフォルムを加えて5回くらいInversionする。
8.
15000 rpm, 5min RT or 4℃で遠心する。
9.
Usedのマイクロチューブに400μlのフェノールクロロフォルム溶液を入れる。
10.
上清を上記のチューブに移し、ボルテックスミキサーで良く混ぜる。
11.
15000rpm, 5min RTで遠心する。
12.
新しいマイクロチューブに900μlの100%エタノールを入れる。
13.
中間層を取らないようにして上清を上記のチューブに入れる。
14.
15000rpm, 10min 4℃ or RT
15.
上清を完全に捨てる。
16.
100μlのTEに再懸濁し、1mg/ml RNaseAを1μl加え、37℃で10min間置きRNAを消化する。
17.
60ulのPEG溶液を加えて良く混ぜたのち、Spindown後氷上に30分以上静置する。
18.
15000rpm, 4℃ 10min遠心後、上清を完全に取り除く。
19.
400μlの70%エタノールをペレットが舞い上がらないようにゆっくりと入れて、チューブを横にして二回転する。
20.
15000rpmで5min RT or 4℃
21.
沈殿を乾燥させて、20μlのTEまたはMQに溶解する。
22.
1μlをアガロースゲル電気泳動にかける。
試薬
SolI 1M
Tris-HCl (pH8.0) 5ml, 0.5M EDTA (pH8.0) 2ml, MQ 88ml オートクレーブ後1M Glucose(フィルター滅菌したもの)を5ml加える。4℃保存
SolII 10%SDSを1,1M NaOHを2、MQを7の割合で混合。室温保存
SolIII 5M AcOK 120ml と酢酸23mlをMQで200mlとしてオートクレーブし、4℃保存