プラスミドDNAの調製

 

1.         LA or TB培地 3mlに竹串または楊枝でシングルコロニーを植菌する(オープンで良い)

2.         37℃でO/N振とう培養する

3.         Usedのマイクロチューブに培養液を入れて、5000 rpm, 1 min 遠心し、上清を捨て、キムワイプ上に逆さまにして培養上清を良く取り除く。上清は廃液入れに。培養チューブはアルカリを入れたバケツにいれる。

4.         100μlSolI 1xLysozyme Bufferを加え、卓上ミキサーで再懸濁する。

5.         200μlSolII(溶菌)SDS NaOH溶液を加え、3-5Inversionして直ちに氷上に移し、そのまま3min静置する。

6.         150μlSolIII(中和)を加え、10回くらいInversionして、さらに5min氷上で静置する。

7.         10μlのクロロフォルムを加えて5回くらいInversionする。

8.         15000 rpm, 5min RT or 4℃で遠心する。

9.         Usedのマイクロチューブに400μlのフェノールクロロフォルム溶液を入れる。

10.      上清を上記のチューブに移し、ボルテックスミキサーで良く混ぜる。

11.      15000rpm, 5min RTで遠心する。

12.      新しいマイクロチューブに900μl100%エタノールを入れる。

13.      中間層を取らないようにして上清を上記のチューブに入れる。

14.      15000rpm, 10min 4℃ or RT

15.      上清を完全に捨てる。

16.      100μlTEに再懸濁し、1mg/ml RNaseA1μl加え、37℃で10min間置きRNAを消化する。

17.      60ulPEG溶液を加えて良く混ぜたのち、Spindown後氷上に30分以上静置する。

18.      15000rpm, 4℃ 10min遠心後、上清を完全に取り除く。

19.      400μl70%エタノールをペレットが舞い上がらないようにゆっくりと入れて、チューブを横にして二回転する。

20.      15000rpm5min RT or 4

21.      沈殿を乾燥させて、20μlTEまたはMQに溶解する。

22.      1μlをアガロースゲル電気泳動にかける。

 

試薬

SolI   1M Tris-HCl (pH8.0) 5ml,  0.5M EDTA (pH8.0) 2ml, MQ 88ml オートクレーブ後1M Glucose(フィルター滅菌したもの)を5ml加える。4℃保存

SolII  10SDS1,1M NaOH2MQ7の割合で混合。室温保存

SolIII  5M AcOK 120ml と酢酸23mlMQ200mlとしてオートクレーブし、4℃保存