GAP repair cloning
1.
前培養液の菌体濃度を測定し、300mlのフラスコに100mlのYPAD液体培地を入れOD600=0.1~0.2となるように植菌
2.
OD600=0.4〜0.8程度になるまで30℃,90rpmで振とう培養する(3〜5時間)。
3.
2本の50mlファルコンチューブに移し、3000rpm,2min遠心して集菌し、無菌的に培地を除く。
4.
1本のチューブにつき20mlの滅菌水で洗浄し再び集菌する。
5.
水を完全にのぞいた後、2mlの0.1M酢酸リチウムを加えvortexで懸濁し、3000rpm,2min遠心して上清を除く。
6.
以下の溶液を2本のチューブにそれぞれ加え、ボルテックスでよく懸濁する。
以下は約48本分
50%PEG(w/v) 6ml
1M酢酸リチウム 900μl
ssDNA(2.0mg/ml) 625μl
DMSO
1ml
三重切断したpYES2 12.5μl
滅菌水 1112.5μl
7.
198
μlずつ96穴プレートに分注。
8.
各ウェルにDNA液2 μl加える。
9.
液漏れのないようにしっかりとシールし30℃で30min静置。
10.
恒温機を用い42℃で20分熱処理をする。3〜5分おきに軽く撹拌する。
11.
遠心後上清を完全に捨て、200μlのYPDA液体培地に懸濁後、30℃,1hour保温。
12.
遠心後、上清を除いて40μlの滅菌水に懸濁し選択培地に植菌する。