GAP repair cloning

1. 前培養液の菌体濃度を測定し、300mlのフラスコに100mlのYPAD液体培地を入れOD₆₀₀＝0.1~0.2となるように植菌

2. OD₆₀₀＝0.4〜0.8程度になるまで30℃,90rpmで振とう培養する(3〜5時間)。

3. 2本の50mlファルコンチューブに移し、3000rpm,2min遠心して集菌し、無菌的に培地を除く。

4. 1本のチューブにつき20mlの滅菌水で洗浄し再び集菌する。

5. 水を完全にのぞいた後、2mlの0.1M酢酸リチウムを加えvortexで懸濁し、3000rpm,2min遠心して上清を除く。

6. 以下の溶液を2本のチューブにそれぞれ加え、ボルテックスでよく懸濁する。

以下は約48本分

50%PEG(w/v)　　　　 　6ml

1M酢酸リチウム　　　 900μl

ssDNA(2.0mg/ml)　 625μl

DMSO 1ml

三重切断したpYES2 　12.5μl

滅菌水　　　 　　　　 1112.5μl

7. 198 μlずつ96穴プレートに分注。

8. 各ウェルにDNA液2 μl加える。

9. 液漏れのないようにしっかりとシールし30℃で30min静置。

10. 恒温機を用い42℃で20分熱処理をする。3〜5分おきに軽く撹拌する。

11. 遠心後上清を完全に捨て、200μlのYPDA液体培地に懸濁後、30℃,1hour保温。

12. 遠心後、上清を除いて40μlの滅菌水に懸濁し選択培地に植菌する。