コロニーPCR

1. 下記のMixtureを調製する。

10x PCR Buffer 1μl

2.5mM dNTPs 　 0.8μl

50mM MgCl₂ 0.6μl

Primer（10 uM） 　 1μl

Primer（10 uM） 　 1μl

H₂O 5.5μl

rTaq　Polymerase 0.1μl

2. 氷上に置いたPCRプレートにMixture10μl入れる。

3. イエローチップでコロニーをつつき、PCRチューブに入れる。

4. あらかじめ98℃に設定してあるサーマルサイクラーにセットする。

5. 以下のサイクル反応を行う。

1. 98℃　　3min

2. 98℃　　10sec

3. 55℃　　25sec

4. 72℃　　最適時間

5. 72℃　　10min

6. 4℃　　 ∞

2〜4のステップを30サイクル繰り返す。

補足

pGEM-Teasyにおいて以下のprimerを用いることでアニーリングステップを省略することができる。

pGEM-Teasy3prime 5’-GGTCGACCTGCAGGCGG-3’

pGEM-Teasy5prime 5’-GCCATGGCGGCCGCGGG-3’

1. 98℃　　3min

2. 98℃　　10sec

3. 72℃　　最適時間

4. 72℃　　10min

5. 4℃　　 ∞

2〜3のステップを28サイクル繰り返す。